熒光定量pcr技術(shù)原理是怎樣的？

　　熒光定量pcr技術(shù)是一種在PCR擴增反應(yīng)中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。以下是對其技術(shù)原理的詳細解釋：

　　

　　1、熒光化學物質(zhì)的使用：

　　

　　熒光染料和探針是兩種主要的熒光化學物質(zhì)。非特異性檢測方法使用過量的熒光染料，如SYBRGreenI，這些染料特異性地摻入DNA雙鏈后發(fā)射出熒光信號。特異性檢測方法則利用標記有熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來識別擴增產(chǎn)物。

　　

　　2、Ct值與起始模板量的關(guān)系：

　　

　　在PCR擴增的指數(shù)期，模板的Ct值（即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）與其起始拷貝數(shù)之間存在線性關(guān)系。這意味著，通過測量Ct值，可以推算出起始模板的數(shù)量。

　　

　　3、標準曲線的建立：

　　

　　為了對未知模板進行定量分析，需要首先建立一個標準曲線。這通常通過使用一系列已知濃度的標準品進行PCR擴增，并測量其Ct值來實現(xiàn)。然后，將Ct值與標準品的起始拷貝數(shù)對數(shù)作圖，得到一條標準曲線。這樣，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

　　

　　4、實時監(jiān)測與定量：

　　

　　qPCR技術(shù)的核心在于實時監(jiān)測PCR進程中的熒光信號變化。隨著PCR循環(huán)的進行，熒光信號逐漸增強，當信號達到預(yù)設(shè)的閾值時，記錄此時的循環(huán)次數(shù)（Ct值）。由于熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步，因此可以通過測量熒光信號的變化來實時監(jiān)測PCR進程，并最終實現(xiàn)對起始模板的定量分析。

　　

　　總的來說，熒光定量PCR技術(shù)結(jié)合了PCR技術(shù)的高靈敏性和光譜技術(shù)的高精確性，使得DNA定量分析更加準確、快速和方便。它廣泛應(yīng)用于基因表達研究、病原體檢測、腫瘤基因檢測等多個領(lǐng)域。